粘附模块实验验证方案

实验目的

验证表达MucPB的大肠杆菌在体外模拟口腔环境、竞争性菌群及小鼠口腔模型中的粘附能力、定植稳定性与生物安全性，评估其作为口腔底盘菌的可行性。

材料

菌株：大肠杆菌Nissle 1917（工程菌及空载体对照）、MG1655、口腔共生菌（如Streptococcus salivarius）、口腔致病菌（如S. mutans等用于竞争实验）。

细胞：人颊上皮细胞系TR146。

实验动物：BALB/c或C57BL/6小鼠，6-8周龄。

试剂：黏蛋白、胶原蛋白I、纤连蛋白、人工唾液、健康人唾液、DMEM/F12培养基、抗生素、结晶紫、Live/Dead BacLight试剂盒、LDH检测试剂盒、16S rRNA引物等。

仪器：CO₂培养箱、厌氧培养箱、酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪、扫描电镜、实时荧光定量PCR仪等。

实验方法

1. 体外粘附与定植稳定性实验：包被96孔板（黏蛋白/胶原蛋白I/纤连蛋白）或培养TR146细胞单层，加入人工唾液或50%人唾液。将过夜培养的工程菌、对照菌重悬至1×10⁸ CFU/mL，加入孔板（细胞组MOI≈100:1），37℃静置培养。于1、4、12、24、48、72 h用PBS洗涤去除未粘附菌，检测粘附率（裂解后涂板）、生物膜（结晶紫染色）、细菌活性（Live/Dead染色）、细胞毒性（LDH释放）。定植稳定性通过每24 h换液50%连续培养72 h后测定残留粘附菌CFU评估。

2. 竞争性定植实验：采集健康人唾液或混合标准菌群（S. mutans, S. salivarius, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum）作为口腔菌群。在黏蛋白/胶原蛋白包被板或TR146细胞单层上，设置目标菌与菌群比例1:1、1:10，另设目标菌单独和菌群单独对照。总菌浓度1×10⁸ CFU/mL，厌氧或微需氧培养。于2、12、24、48 h洗涤后，选择性培养基计数目标菌，血平板计数总菌，16S rRNA qPCR或测序分析菌群结构，测定生物膜总量和pH。

3. 小鼠口腔定植实验：小鼠随机分组（工程菌组、空载体组、野生型组、PBS空白组、阳性对照菌组），每组6-8只。预处理：饮水中添加链霉素（5 g/L）3天或0.12%氯己定涂抹口腔2天。将过夜菌体离心重悬于PBS至1×10¹⁰ CFU/mL，每只小鼠口腔涂抹50 μL（颊黏膜、舌背、牙面），禁食禁水1 h。于1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d用口腔拭子采样，处死后取颊黏膜、舌、牙龈组织匀浆涂板计数；取脾、肝、肾匀浆检测细菌移位。检测定植数量、滞留时间、组织切片H&E染色、ELISA检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、16S rRNA测序分析菌群变化（可选）。

数据分析

粘附率、生物膜量、活菌比例等以均值±SD表示，组间比较采用t检验或ANOVA（P小于0.05为显著）。竞争实验中计算目标菌相对丰度。小鼠实验绘制定植衰减曲线，计算半衰期；炎症因子水平与空白组比较；统计细菌移位发生率。

预期结果

体外粘附：工程菌1 h粘附率≥10⁶ CFU/well，显著高于对照（P小于0.01）；24 h生物膜形成显著增强；72 h粘附菌维持初始50%以上，活菌比例大于80%，LDH释放小于5%。

竞争定植：1:1混合24 h后工程菌相对丰度大于30%；1:10初始劣势下仍可维持5-10%（空载体小于1%）；工程菌增强总生物膜量，pH维持在5.8-6.5，不显著抑制有益菌。

小鼠定植：24 h检出10⁴-10⁵ CFU/拭子，7 d仍可检出大于10² CFU/拭子（对照组3 d内清除）；组织无炎症浸润，炎症因子水平与空白组无差异，脾肝肾未检出工程菌；菌群多样性无明显下降。

学习与优化

若粘附力不足：优化MucPB表达强度、尝试其他粘附素（如Fap2）或串联表达。

若竞争定植能力弱：增强菌株环境胁迫耐受性，或联用益生元。

若小鼠定植时间短：增加接种频率、使用黏膜黏附剂（如壳聚糖）或优化预处理。

若出现炎症反应：降低接种量或进一步衰减毒力基因。

安全模块实验验证方案

实验目的

验证基于CRISPR/dCas9的AND逻辑门能否正确响应pH和表面接触信号，仅在两个条件同时满足时允许细胞存活，其他条件下高效启动自杀。

材料

菌株：大肠杆菌Nissle 1917（可选用ΔtolC或ΔccdB敏感背景）。

质粒：pPgad-dCas9-VP16（pH响应）、pPmuc-sgRNA（接触响应）、pPlacUV5min-ccdA（合成启动子驱动解毒蛋白）、pJ23100-ccdB（组成型毒素）、报告质粒pPgad-gfp和pPPlacUV5min-gfp。

试剂：黏蛋白、不同pH的LB培养基、抗生素、SYTO9/PI活死染色试剂盒。

仪器：微孔板读数仪、共聚焦显微镜、流式细胞仪。

实验方法

1. 传感器功能验证：

- pH响应：转化pPgad-gfp，分别接种于pH 5.0、6.0、7.0、8.0的LB，培养6 h，每小时测定OD600和GFP荧光，计算荧光/OD比值。

- 接触响应：转化pPcontact-gfp，分别在悬浮（振荡）和附着（黏蛋白包被板静置）条件下培养6 h，测定附着菌与悬浮菌的荧光强度。

2. AND逻辑门功能验证：将四个质粒共转化至E. coli，构建完整工程菌，并设无ccdB、无ccdA、组成型ccdA对照。设置四组培养条件：pH 7+附着、pH 7+悬浮、pH 5+附着、pH 5+悬浮。接种后培养8 h，每1 h测OD600，终点进行活菌计数（CFU/mL），并用活死染色观察细胞状态。

3. 自杀彻底性验证：将工程菌在非允许条件（如pH 5悬浮）下培养24 h，取培养液涂布LB平板，观察是否有菌落生长。若有，挑取克隆重复实验并测序。

4. 逻辑门泄漏检测：在允许条件（pH 7附着）下观察生长是否正常，若生长受抑说明系统有泄漏。

数据分析

传感器验证：绘制pH-荧光曲线，计算诱导倍数（大于10倍为佳）。AND门功能：比较四组OD600和终点CFU，预期仅在条件1有显著生长，其他组CFU应低于检测限或比条件1低大于1000倍（t检验/ANOVA）。自杀效率=1 - (CFU_其他/CFU_允许)应大于99.9%。

预期结果

Pgad在pH 7时荧光最强，pH 5时极低（诱导比大于20倍）。

Pmuc在附着条件下荧光比悬浮高10倍以上。

完整工程菌仅在pH 7且附着条件下生长良好，其他三组CFU减少大于1000倍。

非允许条件培养24 h后涂板无菌落生长，无逃逸。

学习与优化

若pH响应不严格：改用天然pH感应系统（PhoP/PhoQ）或CadC系统。

若接触响应不特异：尝试生物膜相关启动子（PcsgD、PflhDC）或机械敏感离子通道。

若允许条件下生长受抑：优化PPlacUV5min或引入转录放大器，调整dCas9-VP16表达。

若出现逃逸菌落：引入双毒素系统（CcdB+MazF）或将模块整合至基因组。

炎症预防自杀模块实验验证方案

实验目的

验证阿拉伯糖诱导的CcdB自杀开关能否在添加阿拉伯糖后快速、彻底杀死工程菌，对阿拉伯糖浓度具有依赖性，且不被其他糖类非特异性激活。

材料

菌株：大肠杆菌Nissle 1917。

质粒：pARAC-ccdB（araC基因和PBAD启动子驱动ccdB），对照质粒pBAD空载体。

试剂：L-阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、细菌活死染色试剂盒、LB培养基、抗生素。

仪器：酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜。

实验方法

1. 浓度依赖性自杀测试：将pARAC-ccdB转化E. coli，接种于含0、0.001%、0.01%、0.1%、0.2%阿拉伯糖的LB中，96孔板培养8 h，每30 min测OD600。终点取各浓度培养液稀释涂板计数CFU，计算相对存活率。

2. 自杀动力学与彻底性验证：在0.2%阿拉伯糖条件下培养，于0、1、2、3、4、6 h取样，一部分活菌计数，一部分活死染色后流式细胞仪分析。24 h后取培养液涂布LB平板，观察有无菌落生长。

3. 特异性验证：分别用0.2%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖替代阿拉伯糖，按上述方法测定生长曲线和终点CFU，以0.2%阿拉伯糖为阳性对照，不加糖为阴性对照。

4. 正交性验证（可选）：将pARAC-ccdB与安全模块质粒共转化，重复上述实验，确认自杀功能不受其他模块影响。

数据分析

绘制不同浓度阿拉伯糖下的生长曲线，计算IC50；比较0.2%阿拉伯糖处理6 h后的活菌数与初始值，计算杀死率（大于99.9%合格）；特异性测试中其他糖类处理组的生长曲线应与阴性对照无显著差异。

预期结果

随阿拉伯糖浓度升高生长抑制越明显，0.2%时几乎完全抑制。

0.2%阿拉伯糖处理6 h后活菌数下降大于1000倍，活死染色显示大部分细胞死亡。

24 h后涂板无菌落生长。

葡萄糖、蔗糖等不能抑制生长，特异性良好。

学习与优化

若抑制不完全或出现逃逸：更换更强毒素（MazF）或使用双毒素系统；引入Lon蛋白酶缺陷菌株提高毒素稳定性。

若阿拉伯糖阈值过高：优化PBAD启动子或araC表达水平，或通过定向进化筛选低浓度响应突变体。

若存在基础泄漏：检查PBAD是否被其他因子激活，或使用更严谨的启动子系统（如鼠李糖调控系统）。