🔄 工程循环

循环1 · 菌株选择
循环2 · 感知灵敏度
循环3 · 三联疗法
循环4 · 安全性设计
参考文献

工程循环

四个工程周期 · 从设计到学习的闭环迭代

循环1 · 菌株选择

1

研究

基于我们的项目目标，对底盘生物提出了以下要求： 首先要对口腔环境有适应性：底盘菌需能在口腔环境中存活，抵抗唾液酶的降解作用，并在口腔微环境中稳定分泌表达目标蛋白。我们希望能找到一种天然定植于口腔和上呼吸道，对唾液中的溶菌酶、乳铁蛋白等具有天然抗性，且能够在牙齿表面和口腔黏膜形成生物膜，实现长期定植的菌种。其次要保证生物安全性：底盘菌不能释放有毒物质影响宿主健康，也不能对口腔原有的微生物群落造成破坏。我们希望菌种具有选择性抑菌活性，可抑制致病菌（如变异链球菌）而不影响有益共生菌，维持口腔菌群平衡。最后，自身要有一定稳定性：底盘菌需能抵抗自身表达的治疗蛋白或其他抗菌物质的影响，不会因自分泌产物而失活。
2

想象

什么样的菌在口腔中稳定存在而不被唾液清除？还是需要引入更强的黏附蛋白？
3

设计与构建

我们使用了pubmed、SynBioHub等检索工具，比对了唾液链球菌K12、大肠杆菌 Nissle 1917和酿酒酵母的优缺点，最终因唾液链球菌K12的特性更适合本项目所以选择了它。
特性 唾液链球菌K12 大肠杆菌Nissle 1917 酿酒酵母
天然栖息地 口腔、上呼吸道 下消化道（肠道） 环境、消化道
口腔定植能力 天然强定植 需额外改造 几乎不定植
安全性认证 GRAS级别 (2025临床验证) GRAS级别 GRAS级别
工程化难度 中等（工具链较少） 容易（工具丰富） 中等
天然抗菌能力 分泌唾液素 无 无
免疫相容性 口腔共生，不触发免疫 肠道共生，口腔可能免疫 真核生物，免疫原性高
4

测试

设计体外黏附实验：将唾液链球菌K12和大肠杆菌Nissle 1917分别与羟基磷灰石珠共培养，通过涂板计数比较黏附率。预期唾液链球菌K12黏附率不低于大肠杆菌Nissle 1917，证明其天然定植能力较强。
5

学习

虽然K12具有天然黏附能力，但文献报道其定植效率仍有提升空间。在下一轮迭代中，我们计划引入Hsa黏附蛋白模块，进一步提高工程菌在口腔中的滞留时间，减少被唾液清除的比例。

循环2 · 感知灵敏度

1

研究

我们搜索并整理了现有的猫口炎诊断与监测方法，发现临床上常通过临床症状评估（如流涎、口臭、牙龈红肿）、口腔探查以及组织病理学检查进行诊断，或通过检测炎症标志物（如TNF-α、IL-1β、IL-6）来评估炎症严重程度。然而我们查阅论文发现，这些方法多为滞后性检测，只能在症状出现后才能干预，无法实现早期预警和精准治疗。因此，我们查询文献，寻找能够实时监测疾病进程的生物传感器元件。
2

想象

如何让工程菌迅速感应到炎症的发生？我们或许可以从致病菌和宿主细胞两方面入手。除此之外如何让微弱炎症信号也能触发强效治疗也是一个值得考虑的问题；我们想到引入信号放大机制。T7 RNA聚合酶系统是一个经典选择：少量T7 pol可激活大量T7启动子驱动的转录，实现信号级联放大。
3

设计与构建

为实现对疾病进程的全面监测，我们设计双通路并联的OR门逻辑——致病菌感知通路利用TLR4/MD-2识别革兰氏阴性菌LPS，激活宿主细胞NF-κB；炎症感知通路直接响应宿主自身炎症状态下产生的NF-κB。两条通路来源的NF-κB均可结合P_NF-κB启动子，驱动T7 RNA聚合酶表达，进而激活下游三联疗法模块。这一设计确保系统既能响应早期致病菌入侵，也能在炎症发生时及时启动治疗，实现对猫口炎“致病菌感染”和“炎症反应”两大关键事件的实时监测与精准响应。
4

测试

设计炎症感知验证实验：将pTest-P_NF-κB-GFP转染至猫口腔上皮细胞，加入TNF-α刺激，预期GFP表达量提高>10倍。设计致病菌感知验证实验：将pTest-PcomA-GFP转化至工程菌，加入LPS刺激，预期GFP表达量提高>10倍。
5

学习

双通路并联设计实现了OR门逻辑，但可能存在信号竞争。下一轮迭代可考虑引入不同强度的RBS调节T7 pol表达量，平衡两条通路的响应强度。

循环3 · 三联疗法

1

研究

我们搜索并整理了现有的猫口炎治疗方法，发现临床上常通过拔牙手术、糖皮质激素（如泼尼松龙）、免疫抑制剂（如环孢素）、干扰素-ω注射、抗生素（如甲硝唑、克林霉素）以及止痛药物等进行缓解与治疗。然而我们查阅论文发现，拔牙虽是根治手段，但创伤大且不可逆，许多猫主人难以接受；长期使用糖皮质激素和免疫抑制剂会导致严重的全身性副作用，如糖尿病、免疫抑制和继发感染；抗生素治疗虽能暂时控制细菌，但易产生耐药性且无法解决根本的免疫紊乱问题。因此，我们继续查询文献，寻找能够从多靶点协同治疗猫口炎的生物活性分子。
IFN-ω针对病毒诱因，从源头减少病毒触发；LL-37控制细菌继发感染，恢复口腔菌群平衡；TGF-β1调节免疫紊乱，从根本上抑制过度炎症反应。三者联用可实现对猫口炎“病毒-细菌-免疫”三大病因的协同治疗，弥补现有单一疗法的不足。因此，我们选择IFN-ω、LL-37、TGF-β1作为三联疗法的核心治疗蛋白。
2

想象

如何用一个启动子同时表达三个治疗蛋白？P2A自切割肽是一个理想选择——它能让三个蛋白从同一转录本翻译后自动分离，实现等比例表达。这样既简化了线路，又保证了协同作用。
3

设计与构建

从NCBI获取IFN-ω、TGF-β1、CAMP（LL-37）基因序列，进行密码子优化（宿主：唾液链球菌）。在SnapGene中构建三联表达盒：PT7-RBS-IFNW1-P2A-CAMP-P2A-TGFB1-终止子。使用P2A(BBa_K1537016)确保等比例表达。
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pSB1C3-FeloVance 质粒图谱

pSB1C3-FeloVance 质粒图谱

图：pSB1C3-FeloVance 三联疗法表达质粒 · 包含 T7启动子、RBS、IFN-ω、P2A、LL-37、P2A、TGF-β1、终止子

4

测试

设计三联表达验证实验：构建pET28a-Pout-三联盒，转化E. coli BL21，IPTG诱导后Western Blot检测。预期三条特异性条带（IFN-ω ~20kDa, LL-37 ~18kDa, TGF-β1 ~44kDa），证明P2A切割成功。设计功能验证实验：分别测试抑菌活性（对P. gulae）、抗病毒活性（对FCV）、免疫调节活性（抑制巨噬细胞TNF-α释放）。
5

学习

P2A串联表达效率受基因顺序影响，文献报道靠近P2A的基因表达量略高。下一轮迭代可尝试不同基因顺序，或引入2A肽突变体优化表达平衡。

循环4 · 安全性设计

1

研究

为了防止口腔中的工程菌离开口腔后发生环境逃逸，需要进一步研究产品的生物安全性问题。文献调研发现，工程菌可能通过两种主要途径离开口腔：被猫吞入胃中，或者随唾液排出到室温环境。因此，我们需要设计能够响应这两种环境变化的被动自杀开关。
2

想象

对于被动自杀开关，如何检测工程菌是否离开了口腔？应该选择什么作为触发开关的条件？我们设想利用胃部的低pH特性作为吞入触发条件，利用口腔与外界的温度差作为环境释放触发条件。两条通路并联，任一触发即可启动自杀程序。
3

设计与构建

我们想到，被猫吞入胃中，也就是进入了酸性环境，pH感应自杀开关（acidTRP）基于Pasr启动子，可在pH<5时激活毒素表达，即在胃酸环境中快速启动下游毒素表达，实现吞入后的快速清除。另一种情况，随唾液排出到室温环境，也就是温度发生了改变；cspA-based温度感应自杀开关（cryodeath），利用冷休克蛋白cspA的5'UTR作为温度感应元件，在室温时激活翻译，37°C时关闭，其在低温下暴露SD序列促进翻译起始，在37°C时形成二级结构遮蔽SD序列。
4

测试

设计安全模块验证实验：将整合双开关的工程菌分别在口腔条件（38°C, pH 7）、室温（25°C, pH 7）、胃酸（38°C, pH 3）培养，2、4、8小时涂板计数。预期口腔条件存活率>90%，室温<1%，胃酸<1%。
5

学习

双开关并联设计实现了“口腔内存活、离体必死”的安全目标，但cspA 5'UTR在25°C时仍有38%活性，可能导致室温下部分延迟死亡。下一轮迭代可筛选更陡峭的温度响应元件，提高开关灵敏度。

参考文献

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