从元件验证到整体功能测试的完整实验设计
3个实验
3个实验
1个实验
P_NF-κB能否响应炎症信号？
TNF-α刺激 → GFP表达检测
P2A能否正确切割三个蛋白？
Western Blot检测IFN-ω、LL-37、TGF-β
双自杀开关是否有效？
口腔/室温/胃酸条件培养 → 存活率检测
LL-37能否杀灭猫口炎致病菌？
Porphyromonas gulae抑菌实验
IFN-ω能否抑制猫杯状病毒？
CRFK细胞 + TCID50测定
TGF-β能否抑制炎症因子？
RAW264.7巨噬细胞 + LPS刺激 + ELISA
在模拟口腔环境中整体功能验证
人工唾液 + 致病菌 + 炎症刺激 → 检测致病菌数、治疗蛋白、炎症水平
质粒： pTest-P_NF-κB-GFP
方法： 转染猫口腔上皮细胞 + TNF-α刺激
检测： 荧光显微镜 + 流式细胞术
预期： GFP表达量提高 >10倍
质粒： pET28a-Pout-三联盒
方法： 转化E. coli BL21，IPTG诱导
检测： Western Blot（三抗体）
预期： 三条特异性条带
菌株： 整合双自杀开关的K12
条件： 口腔、室温、胃酸模拟
检测： 涂板计数存活率
预期： 非口腔环境存活率<1%
靶标： Porphyromonas gulae
方法： 抑菌圈实验 + MIC测定
预期： 抑制率 >90%
靶标： 猫杯状病毒 (FCV)
方法： CRFK细胞 + TCID50测定
预期： 病毒滴度降低 >100倍
细胞： RAW264.7巨噬细胞
方法： LPS刺激 + ELISA
预期： TNF-α/IL-6降低>70%
条件： 人工唾液（含黏蛋白，pH 7.0, 38°C）
分组： 工程菌 + 致病菌 + 炎症刺激
检测指标：
预期结果：
[1]Sakamoto T, Yamaguchi Y, Goto T, Takahashi N, Kawada T. An in vitro analysis system using a fluorescence protein reporter for evaluating anti-inflammatory effects in macrophages. Biosci Biotechnol Biochem. 2011;75(8):1582-7. doi: 10.1271/bbb.110278. Epub 2011 Aug 7. PMID: 21821941.
[2]Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Sep;76(9):4350-4. doi: 10.1073/pnas.76.9.4350. PMID: 388439; PMCID: PMC411572.
[3]Özavci V, Erbas G, Parin U, Yüksel HT, Kirkan Ş. Molecular detection of feline and canine periodontal pathogens. Vet Anim Sci. 2019 Aug 27;8:100069. doi: 10.1016/j.vas.2019.100069. PMID: 32734086; PMCID: PMC7386636.
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[6]Ivy, A., Bess, S.N., Agrawal, S. et al. A dual-fluorescence assay for gene delivery vehicle screening in macrophages with an inflammation-inducible reporter construct.