Lab Notebook

1. 计算机辅助设计

使用SnapGene软件模拟克隆过程，进行虚拟的琼脂糖凝胶电泳， 以确定用于诊断性消化的最合适的限制酶，并确认条带模式， 从而在进入实验室之前确认最佳的实验流程并确保结果的准确性。

2. 载体构建

将不同的T7启动子克隆到pUPD2载体中。候选启动子包括：

• BG37
• BG42
• BG17
• J23119
• P3.1
• osmY

我们将基本部分从pEGB2载体转移到pDGB3a1和pDGB3a2载体中， 以组装α水平构建体。随后转化到大肠杆菌BL21 DE3细胞中。

3. 菌液培养与诱导

第二天：制备液体培养物以促进转化细菌的生长和适应，37°C温育过夜。

第三天：离心培养物并用NaOH洗涤所得沉淀两次。 稀释至OD600 = 0.4，在37°C诱导6小时。

检测：在酶标仪和荧光倒置显微镜下观察细胞的荧光强度。

1. 菌株活化

将pSB1A3-PgrpE（可替换为PsoxS等多种启动子）-mRFP的 多个报告菌株的甘油菌液划线接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上， 37°C培养16小时。

挑取单菌落接种至5 mL含相同抗生素的LB液体培养基中， 37°C、250 rpm振荡过夜培养约16小时。

2. 菌液稀释

将过夜培养物以1:100比例转接至50 mL三角瓶内的10 mL新鲜LB培养基中， 在相同条件下继续培养至OD600 = 0.6 ± 0.05。

3. VOCs处理

将VOCs储备液先用无菌去离子水稀释至0.1%，使用前再稀释1000倍。 在96孔黑色透明底微孔板中：

• 每孔加入90 μL细菌培养液
• 再加入10 μL稀释后的VOCs溶液（终体积100 μL）
• 对照组加入10 μL无菌去离子水

用透气膜封板后，37°C静置孵育4小时。

4. 荧光检测

孵育结束后，将微孔板轻柔振荡10秒：

• 测量OD600，以评估细胞密度
• mRFP荧光在584 nm激发波长和607 nm发射波长下记录

最终测量归一化荧光强度。 使用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

1. 菌株准备与活化

将两组菌株进行培养：

• 转染有pAc-sgRNA-cas9质粒的大肠杆菌
• 未处理的野生型大肠杆菌

划线接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养16小时。 挑取单菌落接种至5 mL含相同抗生素的LB液体培养基中， 37°C、250 rpm振荡过夜培养约16小时。

2. 大规模培养

将400 mL含抗生素（如需要）的LB培养基预热至37°C， 接种后振荡培养16-20小时。定期测量OD值。

3. OMV分离与纯化

将40-45 mL培养物分装至8个50 mL离心管中。

第一次离心：6000 × g，20分钟，4°C，去除完整细菌细胞。

上清液处理：转入离心管中，再次离心。

第二次离心：100,000 × g，2小时，4°C，沉淀粗OMV。

用PBS重悬沉淀至10 mL，用0.22 μm滤膜过滤， 进一步去除杂质和可能的活菌。