实验设计
实验针对肠道靶向除臭工程菌开展系统性验证，从功能实现、节律调控、生物安全三方面搭建完整实验体系。
一、核心除臭模块
验证思路：采用「表面展示→调控表达→结合前体→屏障拦截」四步递进验证思路，系统拆解除臭功能的实现路径。
步骤 1（表面展示验证）
实验方法：首先通过蛋白酶 K 消化联合免疫荧光标记实验，验证 ApoD 蛋白成功锚定在菌体表面。
预期结果：蛋白酶 K 处理可使 ApoD 条带消失，流式细胞术检测呈现荧光阳性。
步骤 2（调控表达验证）
实验方法：进一步利用 RpaA 磷酸化突变体 (D53E/D53A) 结合 GFP 报告质粒，证实 KaiBC 节律系统对功能蛋白的精准调控。
预期结果：模拟磷酸化的 D53E 组 GFP 荧光信号显著高于非磷酸化的 D53A 组。
步骤 3（结合前体验证）
实验方法：随后通过工程菌与臭味前体 HMHA 共孵育，结合 HPLC-MS 技术检测上清液，确认工程菌可高效结合并清除 HMHA。
预期结果：工程菌组上清中 HMHA 残留浓度显著低于对照组。
步骤 4（屏障拦截验证）
实验方法：最后借助 Caco-2 Transwell 肠上皮模型模拟肠道屏障环境，检测基底侧 HMHA 含量。
预期结果：证明工程菌能显著拦截前体分子穿透肠屏障，有效减少其入血风险，从源头实现除臭目标。
二、昼夜节律调控模块
验证体系：构建「体外重构→体内报告→通路验证」的三级验证体系，全面解析节律系统的功能与调控机制。
步骤 1（体外层面验证）
实验方法：体外层面，重构 KaiABC 蛋白与 ATP 反应体系，通过 Phos-tag 电泳技术。
预期结果：确认 KaiC 蛋白磷酸化水平呈现 24 小时自主振荡规律。
步骤 2（体内层面验证）
实验方法：体内层面，将三质粒共转化至大肠杆菌，经阿拉伯糖诱导后实时监测荧光信号。
预期结果：验证节律输出的稳定性与人为可调可控性。
步骤 3（通路层面验证）
实验方法：通路层面，构建 △SasA/RpaA 基因缺失株，通过检测报告基因表达及 RpaA 磷酸化水平。
预期结果：明确 SasA/RpaA 是连接核心节律振荡与下游功能蛋白表达的关键信号通路，保障功能输出的节律性。
三、生物安全模块
设计理念：基于缺氧与 37℃ 双信号驱动的「与非门」逻辑，搭载 MazF 自杀基因，通过多维度实验严格验证环境安全性。
步骤 1（输入信号元件独立性验证）
实验方法：首先验证输入信号元件的独立性。
预期结果：pfnrS-GFP 与 Y38-RFP 分别响应缺氧与 37℃ 信号，两者表达互不干扰。
步骤 2（「与门」逻辑严谨性验证）
实验方法：随后验证「与门」逻辑的严谨性。
预期结果：双信号存在时 TetR 阻遏自杀基因，仅 37℃ 厌氧环境下 TetR 高表达、GFP 低表达，其他条件下则相反。
步骤 3（「与非门」自杀验证）
实验方法：进一步通过「与非门」自杀验证。
预期结果：确认仅在肠道模拟环境 (37℃ 厌氧) 中工程菌可正常生长，脱离该环境后 2 小时内活菌数下降超 1000 倍，6 小时内近乎消亡。
步骤 4（模拟环境与稳定性实验）
模拟环境实验结果：证实工程菌在模拟肠液中稳定存活，在模拟水体中 2-4 小时内活菌归零。
长期遗传稳定性评估结果：显示，工程菌逃逸频率低于 10⁻⁸，突变热点集中于 tetR 或 pTet 区域，无环境扩散风险，符合严格的生物安全标准。
